吕玉山
（泸州北方纤维素有限公司，四川 泸州 646605）
摘要：测试纤维素酶一定时间作用前后试样水溶液的粘度变化，通过计算粘度保持率表征试样抗生物稳定性，分析方法中温度、湿度等外界因素对实验准确性的影响，形成完整的分析方法，并与国内外产品抗生物性能进行对比。
关键词：羟乙基纤维素；纤维素酶；粘度保持率；抗生物稳定性
前言
粘度稳定性是HEC的一项重要应用性能指标，也是客户选择HEC产品的一项重要考核指标[1]。目前，表征纤维素醚产品粘度稳定性的方法分为生物酶稳定性试验和水溶液粘度贮存稳定性试验[2]两种。生物酶稳定性试验在前期摸索试验中具有测试周期短、结果重现性高、能及时指导生产及发货等优点。因而，建立了生物酶稳定性试验分析方法。由于羟乙基纤维素主要应用于涂料等领域[3]，而该体系环境多为碱性，多数客户要求能够在碱性环境下迅速分析出HEC的稳定性，但中性纤维素酶在碱性环境下会失去活性，因此建立了适宜碱性、中性环境下的HEC生物酶稳定性测试方法。
本论文讨论只涉及两种纤维素酶分析方法中温度、湿度等外界因素对试验分析准确性的影响，并在确定的分析条件下，将我公司产品与国内产品进行抗生物稳定性能对比。
1试验原理及试验流程
1.1试验原理
在适宜的条件下，纤维素酶可以将HEC降解。在纤维素酶的作用下，HEC分子链可看成由可被酶降解的未取代葡萄糖链段[4]（这里用G表示），以及不可被酶降解的已取代葡萄糖链段（这里用S表示）组成，见图1。由于HEC分子链的断裂，试样的水溶液粘度会下降，所以可以通过在纤维素酶作用的一定时间内，HEC水溶液粘度的变化程度来表征该试样的抗生物稳定性。
图1 HEC在纤维素酶作用下的降解示意图
1.2试验流程
将HEC试样配制成1%质量浓度的水溶液，待试样完全溶解后测试其初始粘度。加入一定量的纤维素酶水溶液，搅拌均匀并开始计时。静置一定时间后再测试试样水溶液粘度，计算粘度保持率。
2试验数据分析
2.1 纤维素酶
收集到纤维素酶A，固体粉末状，溶于水。对纤维素酶的酶活性、加量和酶降解时间分别进行试验，使试样水溶液在酶降解后仍然具有一定的粘度，并且使不同品质的试样的粘度保持率有一定的差距，达到能够比较的目的。粘度保持率太低，说明纤维素酶的酶活性太大、加量太高、或酶降解时间太长，使得不同试样的试验结果都比较接近，在试验误差的影响下，失去了试验的意义；反之亦然。
2.2 纤维素酶加量的确定
对纤维素酶A进行了加量的选择试验，分别称取了一定量的纤维素酶，定容至500mL，移取2.00mL±0.02mL加入试样水溶液中并混合均匀，静置2h、4h、6h后分别测试水溶液粘度，计算粘度保持率。试验结果见表1。
表1 纤维素酶加量选择试验
批号 |
加量 |
粘度保持率（%） |
||
2h |
4h |
6h |
||
HE162136 |
0.0400±0.0002g |
24.6 |
10.9 |
6.4 |
0.0200±0.0002g |
31.5 |
22.3 |
14.7 |
|
0.0100±0.0002g |
60.9 |
43.7 |
27.2 |
|
0.0010±0.0002g |
88.7 |
81.5 |
77.0 |
|
HE161165 |
0.0400±0.0002g |
25.7 |
12.1 |
8.9 |
0.0200±0.0002g |
33.2 |
25.8 |
18.3 |
|
0.0100±0.0002g |
65.4 |
50.5 |
38.9 |
|
0.0010±0.0002g |
92.1 |
84.8 |
80.2 |
|
结论：
①随着纤维素酶加量成倍数逐级降低，在相同酶降解时间下，粘度保持率成接近倍数的关系逐级上升。
②纤维素酶加量在0.04g、0.02g时，酶降解2h后，2个试样几乎降解完成，所以在酶降解4h、6h时粘度下降幅度不大，且2个试样在3个时间段的粘度保持率虽有一定差距，但并不明显，因而判定0.04g、0.02g加量过多。
③纤维素酶加量为0.001g时，2个试样在酶降解6h内粘度降速过慢，粘度保持率差距都很小，因而判定0.001g加量过少。
④纤维素酶加量为0.01g时，随着酶降解时间的延长，2个试样在3个时间段内保持了一定的下降幅度，而且粘度保持率之间的差距越来越大，满足了试验目的。
综上所述：纤维素酶A的最佳加量为0.0100±0.0002g，定容至500mL，移取量配制溶液2.00mL±0.02mL。
2.3 酶降解时间确定
在纤维素酶加量的选择试验中，我们已经进行了酶降解时间的试验。由表1可知，在纤维素酶A最佳加量下，酶降解6h时的粘度保持率已能进行不同品质的试样的比较，无需再进行更长时间的酶降解。而且过长的试验时间，会影响试验效率。
综上所述：最佳酶降解时间为6h，可根据需要测试酶降解2h、4h粘度保持率观察酶降解过程。
2.4试验分析方法确定
取297±0.02g蒸馏水置于带有瓶塞的广口瓶中，称取3.00±0.02g待测样品，加入到上述水溶液中（倒样前先开启搅拌），搅拌到3h直至样品溶解，将溶解好的纤维素水溶液样品放入恒温槽保温到25±0.2℃，测试初始粘度；
取0.0100±0.0002g纤维素酶溶于50g水中。充分搅拌溶解后加入到容量瓶中定容至500mL。所配制的纤维素酶水溶液必须2h内使用。使用前再摇匀；
将配制好的纤维素酶水溶液用移液管取2.0mL加入到纤维素水溶液中，搅拌均匀后于25±0.5℃的恒温环境中放置两小时后测量纤维素水溶液的粘度n，然后六小时后再测水溶液的粘度；
粘度保持率=n(添加纤维素酶后两小时后的粘度)/m（纤维素水溶液初始测量粘度）。
3影响因素分析
3.1pH的影响
根据文献资料收集显示，HEC在pH值2~12内粘度很小，否则黏度会下降。溶液在pH值6.5~8.0内有极佳的粘度稳定性[5]，而纤维素酶活性对pH值有一定要求[6]，为保证粘度测定和分析方法准确性，控制pH值以达到最佳测试环境。目前，我公司建立了生物酶稳定性分析方法主要有两种，分别为中性纤维素酶分析方法和碱性纤维素酶分析方法，试验设计不同pH值体系进行稳定性对比分析，试验参数及结果见表2。
表2pH值对分析方法的影响
批号 |
中性纤维素酶分析方法 |
碱性纤维素酶分析方法 |
||
pH值 |
6h粘度保持率（%） |
pH值 |
6h粘度保持率（%） |
|
HD3万产品 （A） |
蒸馏水 |
37.9 |
6.0 |
70.2 |
6.0 |
32.7 |
7.0 |
60.4 |
|
7.0 |
36.6 |
8.0 |
58.1 |
|
8.0 |
42.3 |
9.0 |
55.2 |
|
9.0 |
50.5 |
10.0 |
68.8 |
|
HD5万产品 （B） |
蒸馏水 |
37.4 |
6.0 |
63.3 |
6.0 |
33.1 |
7.0 |
55.5 |
|
7.0 |
37.4 |
8.0 |
53.9 |
|
8.0 |
42.8 |
9.0 |
49.8 |
|
9.0 |
51.2 |
10.0 |
60.2 |
|
结论：（1）针对中性纤维酶分析方法而言，随着溶液pH值的升高，试验6h粘度保持率逐渐升高，说明高pH值会抑制纤维素酶的活性。HEC的pH值一般在7.0左右，最高不会超过8.0，而且配制缓溶液的无机盐可能会对纤维素酶有一定影响，所以用蒸馏水溶解的试样水溶液，与用pH7.0缓冲溶液溶解的试样水溶液，具有比较接近的6h粘度保持率。因理化室常用蒸馏水溶解试样，所以最佳pH值为7.0。
（2）对碱性纤维素酶分析方法，随着溶液pH值的升高，6h粘度保持率逐渐减小，说明高pH值会激发纤维素酶的活性，而当pH值达到10.0时，碱性纤维素酶活性明显下降，所以该碱性纤维素酶在pH9左右时，活性达到最大，也能满足碱性环境下的测试需求，试样溶液达到pH9.0±0.5时为最佳测试条件。
3.2温度的影响
HEC溶液的粘度随着温度升高而降低[5]，而纤维素酶在一定温度范围下活性却是在温度升高活性增加[6]，控制温度变量对生物酶稳定性分析方法至关重要。根据已确定的pH值条件下，选择不同的温度进行对比分析以确定最佳两种分析方法最佳实验温度，参数及试验结果见表3。
表3温度对分析方法的影响
批号 |
中性纤维素酶分析方法 |
碱性纤维素酶分析方法 |
||
温度（℃） |
6h粘度保持率（%） |
温度（℃） |
6h粘度保持率（%） |
|
HD3万产品 （C） |
20 |
41.2 |
20 |
58.6 |
25 |
35.5 |
25 |
51.7 |
|
30 |
33.0 |
30 |
48.7 |
|
40 |
18.0 |
40 |
28.5 |
|
HD5万产品 （D） |
20 |
42.1 |
20 |
58.3 |
25 |
37.4 |
25 |
48.9 |
|
30 |
33.8 |
30 |
45.8 |
|
40 |
18.5 |
40 |
30.0 |
|
结论：随着温度的升高，试样水溶液的6h粘度保持率逐渐降低，说明较低的温度会抑制纤维素酶的活性，而较高的温度会增强纤维素酶的活性。因HEC粘度测定一般都是25℃，故本试验中最佳试验温度为25℃。
3.3大气湿度的影响
大气湿度可以无需考虑[7]，因为测试的都是水溶液，并且处于密闭状态，湿度对试验结果的影响甚微。
4产品稳定性能对比
用已确定的HEC生物酶稳定性分析方法，在最佳的温度和pH实验条件下，将公司的HD3万、HD5万、HB10万产品同国外样E、国外样F、国内样J和国内样I进行稳定性能对比，性能对比见表4。
表4HEC抗生物酶稳定性对比
图2 样品稳定性能对比
从国内外产品和我公司生产的不同型号羟乙基纤维素生物稳定性能对比来看，我公司生产的HD3万、HD5万和HB10万产品抗生物酶稳定性能稳定优良，目前已和国外知名羟乙基纤维素生产厂家的产品F稳定性能相当，且HD3万、HD5万和HB10万产品抗生物稳定性能已经超过国外产品E。不管是酶环境下存放时间长短，保持率（粘度降幅）都维持在60%左右，该良好的生物稳定性能对单独以HEC作为乳胶漆增稠其产品粘度重现性、抗分水效果、产品贮存过程粘度稳定性都具有优良作用 [8]。而与国内主要生产厂家产品相比较，我公司产品在12h后粘度降幅已趋于稳定，而国内产品J和I的抗生物酶稳定性能较差，且酶环境存放时间越长，呈现严重的降粘状态越是明显，这样国内产品J和I要达到不影响产品稳定性就得增加其它成本[9]。
综上所述，以HEC作为增稠剂的乳胶漆，只有选择抗生物酶稳定性好的HEC，才能确保乳胶漆储存稳定性优越，乳胶漆在保质期内存放，环境如何变化，均保持均匀的粘度和均匀的颜料悬浮状态。所以，HEC抗生物酶稳定性对涂料产品生产与应用至关重要。
参考文献：
[1] 邵自强.纤维素醚[M].北京：化学工业出版社，2001.108-140
[2] 张骏.羟乙基纤维素的生产及应用前景.化工科技市场[J].2000.4
[3] 林宣益.乳胶漆[M].北京：化学工业出版社，2006.1
[4] XIE J B,HSIEH Y L.Biocatalysis in Polymer Science[M].Washington:Amer Chemical Soc,2003(840):200-230.
[5] 朱刚卉.羧甲基纤维素钠和羟乙基纤维素在日化才产品中的应用.日用化学科学[J].2005.28.4
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[7] 吴自强，吴昱；羟乙基纤维素合成与应用.化学建材[J].1995年.06期.
[8] Blake D.M. Coating Technol[J].1983,55(701):29-34
[9] 涂伟萍.水性涂料[M].北京：化学工业出版社，2006.79
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